壳寡糖抑制肿瘤作用的研究﹡（上）
杜昱光 白雪芳 金宗濂1  燕秋2 朱正美2
（中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023）

    摘 要：本文通过对几种寡聚糖对Sarcima-180癌细胞的抑制作用试验，筛选出其中有较强抑瘤作用的壳寡糖。并对不同工艺制备的壳寡糖用体外抑瘤方法进行抑瘤活性比较，结果表明：3种壳寡糖中对癌细胞DNA合成的抑制作用效果最好的是C-III-2，抑制率达98.5%。将不同剂量的壳寡糖（C-III-2）经口给予小鼠30天后，与对照组比较，中剂量组（6.7mL/kg.bw）的荷腹水瘤小鼠存活时间延长34%，荷实体瘤小鼠瘤重降低63%；高剂量组（20.0mL/kg.bw）的荷腹水瘤小鼠存活时间延长35%，荷实体瘤小鼠瘤重降低76%；实验结果表明口服中剂量或高剂量壳寡糖C-III-2对肿瘤有抑制作用.壳寡糖C-III-2对多种肿瘤细胞体外的抑制作用试验表明：壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，抑制率平均达76%，高于顺铂组及对照组；同时对小鼠肝癌腹水细胞的生长也有一定的影响。
    关键词：壳寡糖  抑制  肿瘤
STUDY ON THE ANTI-TUMOUR MARINE DRUGS OF CHITOOLIGOSACCHARIDE
Du Yuguang  Bai Xuefang  Jing zhonglian  Yan Qu Zhu Zhengmei
( Dalian Institute of Chemical and Physics,
Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023)
    ABSTRACT  Three kinds of oligosaccharide from different sources have been tested and compared for their in vitro inhibitory activities on Sarcima-180 cancer cells.  The results indicate that the preparation C-III-2 from chitooligosaccharides show the highest inhibitory activity (98.5%) on DNA synthesis in tumor cells. The tested mice were given orally with different dosages of chitooligosaccharide C-III-2 for 30 days.  The medium dosage (6.7ml/kg.bw) and high dosage(20ml/kg.bw) extended mouse
life by 34% and 35% and reduced tumor weight by 63% and 76% respectively, compared with control. Other test results show that the chitooligosaccharide also inhibited tumor cells from human liver by 76%.
    key word  chitooligosaccharide, anti-tumour

    * 国家自然科学基金项目（39980012）、国家科委“九五”攻关项目(96-C03-01-01)、中国科学院“九五”重点项目（KY95-S1-220）、
    1 北京联合大学应用文理学院，北京100083；  
    2 大连医科大学生化教研室，大连116023；
    壳寡糖通常是由甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖的降解而获得的2-10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有多种优异的生理功能，它能提高机体的免疫能力和抗癌能力[1]，改善肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长[2]，还可作为植物功能调节剂，刺激植物生长[3]，增强植物对病虫害的防御能力[4]。因此，对它的研究及开发利用，具有十分重要的意义。
根据壳寡糖具有抑制肿瘤生长的生理功能，利用经过酶降解及反应分离耦合等生化工程新技术,采用不同工艺制备的壳寡糖，进行了抑瘤活性筛选、体外及体内抑瘤作用试验，试验方法及结果如下：
1材料与方法：
1.1 材料:
1.1.1 甘露寡糖(由中科院微生物所提供)
1.1.2 磺化甘露寡糖(由中科院微生物所提供)
1.1.3 壳寡糖（由中科院大连化物所603组提供）
1.1.4 患S-180腹水癌昆明小鼠（由北京药物所提供）
1.1.5 昆明种1月龄雌性二级小鼠，体重18-22g（中国医学科学院动物中心繁育场提供）
1.1.6 肝癌、宫颈癌（Hela）、红白血病（K562）、淋巴白血病（Raji）四种人肿瘤和小鼠肝癌腹水（Hepa）（由大连医科大学病理教研室提供）
1.1.7 小鼠肝癌高淋巴道转移细胞系HCa-F（由大连医科大学病理教研室提供）
1.2 方法：
1.2.1 壳寡糖的制备
    壳寡糖（低聚氨基葡萄糖）是以蟹、虾的外壳甲壳质（几丁质），经脱乙酰化处理后得到壳聚糖为原料，通过酶降解及反应分离耦合等生化工程技术制备而成。不同的制备工艺得到不同的壳寡糖,即C-III-2，C-II-2，C-I-2.
1.2.2 壳寡糖的测定方法
    通过盐酸水解成游离氨基葡萄糖释出,以水为对照，在535nm处测定光密度值。由标准曲线求出中氨基葡萄糖的含量[5] 。
1.2.3同位素掺入实验方法
    由已接种7-8天患S-180腹水癌昆明小鼠5只，无菌制成混合腹水，染色，镜检，癌细胞≥95%，用Eagle，s液稀释成3.5×106/ml。实验分成本底、对照和实验等三组，每个样设三个平行管。各管按上述顺序加完后，混匀，37℃保温4小时后，细胞收集器收集癌细胞于玻璃纤维膜、用冷生理盐水洗涤2次每次5秒钟，间隔空抽2秒。最后用10%TCA洗涤并固定细胞，干燥，置于闪烁杯中，消化，冷却，各管加7ml闪烁液。LKB-1209全自动液闪仪进行测量（cpm）。按公式抑制率=[对照管（cpm）－实验管（cpm）]/对照管（cpm）×100%计算样品对癌细胞DNA合成的抑制率。
1.2.4 壳寡糖的筛选方法
    以不同批次的壳寡糖C-III-2（48.3mg/ml），C-II-2（52.3mg/ml），C-I-2(47.6mg/ml)为原液、稀释10倍和稀释100倍三个剂量，除空白对照外，其余各组均设无瘤细胞组，最后计算抑制率。
1.2.5 动物试验的剂量
    小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。分别以人体推荐剂量的5倍、10倍和30倍作为低（3.3ml/日/kg体重）、中（6.7ml/日/kg体重）、高（20.0ml/日/kg体重）剂量。采取灌胃法，每日灌胃一次，对照组灌蒸馏水。各组小鼠连续给予受试物30天。
1.2.6 移植性肿瘤试验（腹水瘤）的方法：
    收集腹腔瘤细胞悬液：H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，传代一次后7～10天的动物，颈椎脱臼处死。固定于蜡版上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤。用消毒空针穿过腹部肌肉，抽取腹水，放入无菌试管内，试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时，应将腹水混合，瘤细胞计数结果。
接种：
    用Hanks工作液稀释瘤细胞悬液至活细胞数为2×106个/mL。在给予受试物15天后将肿瘤细胞接种于空白对照组、环磷酰胺对照组和低、中、高剂量组小鼠的腹腔内，每只小鼠0.2 mL。继续给予受试物15天。同时环磷酰胺对照组腹腔注射环磷酰胺1.5mg/天/只。观察各组小鼠的存活时间。本试验需重复一次。接种后次日起逐日记录体重，并观察记录动物死亡情况。
1.2.7 移植性肿瘤试验（实体瘤）的方法
    收集腹腔瘤细胞悬液：H22瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，传代一次后7-10天的动物，颈椎脱臼处死。固定于蜡版上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤。用消毒空针穿过腹部肌肉，抽取腹水，放入无菌试管内，试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时，应将腹水混合，瘤细胞计数结果。接种方法同上。
1.2.8 小鼠碳廓清实验的方法
   对每只小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁，0.1mL/10g体重。待墨汁注入后立即记时。分别于注入墨汁后1、10min取血0.02mL加至2mL碳酸钠溶液中，600nm波长处测定光密度值，以碳酸钠溶液作对照。另取肝脏和脾脏称重。以吞噬指数来表示巨噬细胞吞噬功能。